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这才是CRISPR基因编辑实验成功的关键点!

导 读

2021年8月5日,美国加州大学伯克利分校的Jennifer Doudna团队在Nature Chemical Bilology发文称开发了一种基于CRISPR的核酸检测新技术来检测新冠病毒,最快20min完成检测,较于传统的RT-qPCR检测方法更快速,这是CRISPR在病毒检测领域应用的又一大进步。

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)即成簇规律间隔的短回文重复序列,它与Cas(CRISPR associated)蛋白组成的系统作为新一代的基因编辑工具,在基因敲入、基因敲除、基因激活、基因沉默、表观遗传修饰及3D基因结构改变中得到广泛的应用[1]


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▲ 基因剪刀CRISPR(图片来源网络)



CRISPR/Cas的应用


? 药物靶点的确定与验证

? 基因环路上下游调控机制分析

? 代谢通路调节机制分析

? LncRNA作用机制分析

? 核酸检测


CRISPR/Cas9系统

CRISPR/Cas9基因编辑系统是包含单链RNAsgRNA,利用与sgRNA的5'端互补的序列将Cas9蛋白引导至目标DNA位点。Cas9 Nuclease对目标DNA序列的PAM依赖性识别并在PAM区上游3bp的特定位点启动DNA切割。

Cas9 Nuclease生成的双链断裂可通过NHEJ(Non-homologous end joining)HDR(Homology directed repair)修复,NHEJ修复通常导致indel突变和基因失活,而HDR可以在提供供体模板时实现高保真的精确基因组编辑。由于生物体具有自我修复机制,随着细胞复制分裂并修复切口,在修复的过程可能产生错配,移码突变、缺失突变,最后筛选出错配纯合子。


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图2:An overview of CRISPR/Cas9 mediated genome editing[2]


CRISPR/Cas9系统成功的关键

? 如何减少和避免脱靶:
采用nick形式的Cas9 Nuclease加双链sgRNA

? sgRNA靶点的选择:

Cas9 Nuclease切割位置在待修饰位点的30bp以内,Z差保持在50bp以内。

? sgRNA品质:

sgRNA活性是影响KI的关键因素之一,因此需要提前验证其活性。

? Cas9 Nuclease形式的选择:

缩短Cas9蛋白在细胞内的存续时间,可以避免连续切割和脱靶,建议使用mRNA或蛋白形式的Cas9。若采用质粒,需要确保其纯度和浓度(建议大于1μg/μl)。


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亿电竞官网(以下简称“亿电竞官网”)经过匠心研发,开发出的sgRNA体外合成试剂盒利用其提供的试剂和使用者自己设计的特异性DNA序列,可在单管反应4小时内获得20-100μg具有功能的高品质的sgRNA,具有合成效率高、品质好、切除效率高等特点。


Hifair? Precision sgRNA Synthesis Kit 测试数据

较高浓度的sgRNA关系到CRISPR/Cas9系统的编辑的效果成败,因此只有加入高浓度的sgRNA方能对基因的编辑起较好效果。亿电竞官网开发出的sgRNA体外合成试剂盒利用其提供的试剂和使用者自己设计的特异性DNA序列,可在单管反应4小时内获得20-100μg,完全满足基因编辑的需要。

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图3:不同时间的sgRNA的合成量


对于sgRNA Synthesis Kit不仅要满足产量上的要求,还需要针对不同种类的sgRNA合成也要达到相当高的产量,方能满足不同类型基因的编辑需要,扩大试剂盒的应用范围。亿电竞官网sgRNA Synthesis Kit经过多个种类的sgRNA的合成,其产量也是很高,可以满足实验所需,因此可以适应多种基因的编辑需要。


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图4:不同种类的sgRNA的合成量

在影响CRISPR/Cas9系统的编辑的效果成败的关键因素中,合成的sgRNA的品质也是关键一环。因为合成的sgRNA的纯度(即品质)不好,对编辑的效率会产生很大影响。亿电竞官网sgRNA Synthesis Kit所合成的sgRNA经过安捷伦2100测定,其纯度单一,说明品质较高,对后续的编辑效率会有很大提升。


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图5:合成的sgRNA的品质(安捷伦2100测定)


最后,所合成的高品质sgRNA是否有活性,需要实地测定才能发现其是否有活性,是否能够与Cas9 Nuclease进行组合达到编辑基因的目的。亿电竞官网sgRNA Synthesis Kit所合成的sgRNACas9 Nuclease进行组合体外切割靶DNA,经琼脂糖凝胶电泳检测发现所合成的sgRNA可以有效引导Cas9 Nuclease在特定位点切割并产生特定大小的DNA片段,因此具备活性。


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图6:sgRNA的剪切效率效果图


亿电竞官网为您提供高品质、高性价比的sgRNA合成试剂盒,让您的CRISPR/Cas9科学研究及相关基因编辑应用如虎添翼,共同为人类的未来健康奉献一份力量。


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Hifair? Precision sgRNA Synthesis Kit

11355ES50/60

50/100T

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Hieff Trans? siRNA/miRNA 体外转染试剂

40806ES02/03

0.5/1 mL

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【1】王晗月,杨晓菲,胡巢凤,李富荣. CRISPR/Cas9基因编辑技术在糖尿病细胞治疗中的应用研究进展[J]. 生命科学,2019,07:723-73.

【2】Lone BA, Karna SKL, Ahmad F, Shahi N, Pokharel YR. CRISPR/Cas9 System: A Bacterial Tailor for Genomic Engineering. Genet Res Int. 2018;2018:3797214. Published 2018 Sep 18. doi:10.1155/2018/3797214.


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